色妹妹情色网 Cell|临床级FFPE样本空间全转录组测序时刻

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空间转录组学时刻卤莽在生物组织原位绘画复杂的基因抒发图谱，正在改良咱们对发育生物学、免疫学、肿瘤学以及疾病病理学的领略【1】。可是，迄今结果，该范畴的征询领域主要荟萃在信使RNA（mRNA）抒发的分析上。真核细胞的转录组由动态种种的RNA分子组成，不仅包括编码卵白合成的熟谙mRNA，还涵盖剪接变体、小RNA过甚他具有调控功能的非编码RNA。因此，对不同RNA物种在其生命周期中的空间定位进行分析，关于全面剖解复杂组织中的RNA生物学至关遑急。

此外，在临床引申中，福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixed Paraffin-embedded，FFPE）组织是病理学会诊的基石。全寰宇的临床病理科蕴蓄了宽阔FFPE组织块，这些材料与详实的临床数据相鸠合，组成了尚未充分诓骗的东说念主体生物学和休养征询的肃肃资源。可是，FFPE样本也带来了特定挑战。在石蜡包埋过程中，样本中的RNA高度片断化，而况在室温储存要求下进一步降解。因此，对临床级FFPE样本中的RNA分子进行空间分析极为痛楚。

2024年9月30日，耶鲁大学樊荣团队的白志亮博士等在Cell杂志上发表了题为Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues的论文，报说念了寰球首个临床级FFPE样本空间全转录组测序时刻——Patho-DBiT。该平台奥秘地诓骗FFPE样本中当然发生的RNA片断化，向等闲种种的RNA分子原位添加poly(A)尾，鸠合微流控条形码标记和算法转换，得手竣事了对临床归档FFPE组织的全秘籍、逐碱基的空间全转录组测序。Patho-DBiT通过对完好意思mRNA、缺失poly(A)尾的片断化mRNA、各种大/小非编码RNA、剪接异构体以及捎带单核苷酸变异（SNV）的前体RNA进行空间条形码标记，精确解码了FFPE复杂组织中丰富的RNA生物学信息，包括单细胞级mRNA图谱、非编码RNA抒发、可变剪接、遗传变异、microRNA调控及RNA动态变化等（图1）。

图1. Patho-DBiT时刻经由及全场景空间分析本事（Credit: Cell）

征询团队在不同组织类型和空间分辨率下对Patho-DBiT进行了充分考据。在小鼠脑冠状切片的分析中，Patho-DBiT在50微米的空间像素中平均检测到6786个基因和31063个特有分子标记（UMI）。聚类分析精确重构了大脑组织的剖解结构，其空间陈列与Allen小鼠大脑图谱上同样切片的区域疑望高度一致。此外，Patho-DBiT拿获了调控大脑遑急功能的基因过甚区域性剪接异构体的抒发，其空间分散与一套孤苦的、通过长读长纳米孔测序取得的新鲜冷冻脑样本数据相吻合。在对室温下存放跳跃5年的T细胞淋巴瘤样本的分析中，Patho-DBiT精确揭示了淋巴瘤发生的基础生物学机制。其转录组拿获的准确性通过在相邻组织切片上使用CODEX时刻进行的高重度免疫荧光空间细胞分型分析得到了考据。

团队接下来使用了100×100的微流控缔造，以20微米的像素尺寸对10，000个点进行条形码标记，空间分解了被会诊为黏膜有关淋巴组织边际区淋巴瘤（MALT）的临床肿瘤活检样本。该组织已在室温下存放跳跃三年。Patho-DbiT通过一次历练即取得了该样品的多重信息。最初，对基因抒发矩阵的无监督聚类分析识别出20个亚群，这些亚群在空间上与组织学结构高度一致。即即是数目较少的特定区域细胞类型，Patho-DBiT也能精确检测，并通过免疫荧光染色考据了其可靠性。征询东说念主员进一步使用最新开荒的狡计平台iStar【2】将分层组织学图像特征索求与转录组学数据相交融，得手竣事了单细胞水平的空间基因抒发映射，大幅晋升了空间细胞异质性的分解本事（图2）。其次，Patho-DBiT卤莽拿获全基因组领域内的序列变异，并生成空间SNV抒发矩阵。它无需依赖已知标记物，通过无监督聚类即可永别肿瘤亚克隆与非恶性细胞，并展望克隆进化关联。此外，该MALT组织的测序数据中有35%的序列映射到了非编码RNA，Patho-DBiT捕捉到了从数十到数千种不同非编码RNA分子的空间分散过甚与肿瘤发生的关联。征询东说念主员零散对microRNA进行了深切分析，因为它们在包括癌症在内的多种病理中起到遑急调控作用。在约2300种已知的东说念主类熟谙microRNA中，Patho-DBiT在MALT切片中检测到了1352种microRNA，其映射序列的长度峰值为21个核苷酸，与此类小RNA的已知长度绝对一致。通过对肿瘤区域和非肿瘤区域的microRNA进行相反抒发分析，征询东说念主员在空间上绘画了microRNA在肿瘤发生中的调控荟萃。

图2. 通过iStar增强的MALT样本高分辨率空间组织结构 （Credit: Cell）

终末，征询团队使用10微米像素分辨率的微流控缔造对充足性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）切片进行了单细胞水平的空间分析。值得醒看法是，该切片与MALT样本同期从团结位患者的胃部不同区域荟萃而来。比拟低度恶性的MALT淋巴瘤，DLBCL具有更高的恶性和侵袭性。通过Patho-DBiT时刻，征询东说念主员得以在细胞水平上精确绘画从初级别肿瘤向高档别肿瘤演化的分子图谱，深切揭示了休养性大B细胞淋巴瘤中肿瘤微环境复杂的互相作用机制。

耶鲁大学生物医学工程系樊荣指示指出：“这是咱们第一次卤莽平直‘看到’各式RNA分子种类，了解它们在临床FFPE组织切片中的位置以及它们的功能。使用这一器用，咱们不错更好地领略每种RNA分子复杂而兴致的生命周期，而不单是是知说念每个基因是否抒发。我以为这将透顶改革咱们改日征询东说念主类生物学的方法。”

耶鲁大学血液病理科主任、资深病理学家Mina Xu（徐路青）指示对这项时刻的使用充满关心: “看成别称长期从事癌症会诊的大夫，我对Patho-DBiT所能看到的细节感到绝顶诧异。我以为，这种深切的分子分析将会极大鞭策咱们对肿瘤生物学的领略。”

耶鲁大学遗传系卢俊指示提到：“非编码RNA是生物医学征询的前沿范畴，可是现存的空间组学时刻在拿获非编码RNA方面存在局限。好多非编码RNA，如microRNA和tRNA等，在生物体内施展着至关遑急的作用。Patho-DBiT 提供了一个优异的科罚决策，不仅卤莽绘画组织样本中卵白编码RNA的二维抒发图谱，还能同期拿获对应的非编码RNA抒发图谱。该时刻为探索非编码RNA在生命过程中的作用及征询包括癌症在内的疾病注入了全新能源。”

费城儿童病院狡计和基因组医学中心主任邢毅指示默示：“我绝顶喜跃卤莽参与这项责任，并探索Patho-DBIT时刻关于生物医学征询的纷乱后劲。咱们的分析标明Patho-DBIT卤莽对FFPE组织进行RNA可变剪接和A-to-I剪辑的空间分析。该时刻为揭示各式生理和病理要求下转录后RNA调控的空间复杂性提供了新鲜的契机。”

宾夕法尼亚大学生物统计和流行病系指示、单细胞与空间基因组学统计中心主任李明瑶指示默示：“我很运道卤莽参与这项慷慨东说念主心的征询，该时刻使咱们卤莽在团结FFPE样本切片中征询扫数RNA分子种类。我也很喜跃看到iStar卤莽进一步晋升这一冲破性时刻的空间分辨率至单细胞水平，使咱们卤莽过去所未有的空间精度探索RNA生物学。”

总之，Patho-DBiT卤莽在临床级FFPE组织中同期进行多种RNA种类和过程的空间分析，具有高贤惠度和等闲秘籍度。此外，它还能进行全基因组领域的SNV定位，并在单细胞水平上分解肿瘤发生的时空过程。评审大师对这项时刻赐与了高度评价，称其为“无情的卤莽表征多种RNA类别空间抒发的时刻”，并以为这是“对空间组学范畴的遑急且实时的孝敬”，将“极大拓展咱们对临床样本生物学的领略”。

参考文件

[1] Bressan D， Battistoni G， Hannon G J. The dawn of spatial omics [J]. Science， 2023， 381(6657): eabq4964.

[2] Zhang D， Schroeder A， Yan H， et al. Inferring super-resolution tissue architecture by integrating spatial transcriptomics with histology [J]. Nature Biotechnology， 2024

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.09.001

责编|探索君

排版|探索君

著作起首|“BioArt”

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